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高效液相色譜儀（HPLC）方法介紹 二維碼
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發(fā)表時(shí)間：2018-07-20 15:01 
高效液相色譜儀（High Pressure Liquid Chromatography）HPLC的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過(guò)程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)。 原理 基本原理示意圖在條件（流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時(shí)（Cs、Cm很?。r(shí)，K只取決于組分的性質(zhì)，而與濃度無(wú)關(guān)。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時(shí)色譜峰為拖尾峰；而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大，K也增大，這時(shí)色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進(jìn)樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時(shí)，才能獲得正常峰。 延伸在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定  高效液相色譜法原理在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動(dòng)相的性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時(shí)間，達(dá)到分離的目的。 色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）也叫高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography）、高速液相色譜（high speed liquid chromatography）、高分離度液相色譜（high resolution liquid chromatography）等或Efficient liquid chromatographyspectrometry。是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。 高效液相色譜是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統(tǒng)由流動(dòng)相儲(chǔ)液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對(duì)其流動(dòng)相為液體的特點(diǎn)作出很多調(diào)整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn)；進(jìn)樣系統(tǒng)要求進(jìn)樣便利切換嚴(yán)密；由于液體流動(dòng)相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長(zhǎng)度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。HPLC應(yīng)用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個(gè)領(lǐng)域。 使用高效液相色譜時(shí)，液體待檢測(cè)物被注入色譜柱，通過(guò)壓力在固定相中移動(dòng)，由于被測(cè)物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同，不同的物質(zhì)順序離開色譜柱，通過(guò)檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào)，最后通過(guò)分析比對(duì)這些信號(hào)來(lái)判斷待測(cè)物所含有的物質(zhì)。高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別，它的特點(diǎn)是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測(cè)器和高效微粒固定相，適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物。 發(fā)展歷史1960年代，由于氣相色譜對(duì)高沸點(diǎn)有機(jī)物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時(shí)代。高效液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個(gè)小時(shí)甚至幾十分鐘內(nèi)完成。 1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書，標(biāo)志著高效液相色譜法 (HPLC）正式建立。在此后的時(shí)間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測(cè)手段，在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與檢測(cè)、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜同時(shí)還極大的刺激了固定相材料、檢測(cè)技術(shù)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。 1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面臨著困境，后來(lái)的研究人員便采用微粒固定相來(lái)突破著一瓶頸。 色譜特點(diǎn)高壓——壓力可達(dá)150～300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。 高速——流速為0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。 高靈敏度——紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。 HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)： 速度快——通常分析一個(gè)樣品在15～30 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。 分辨率高——可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。 靈敏度高——紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。 色譜柱可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。 樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。 主要類型液固吸附色譜1.1分離原理 液固色譜是基于各組分吸附能力的差異進(jìn)行混合物分離的，其固定相是固體吸附劑。 1.2固定相 ；吸附色譜固定相可以分為極性和非極性兩大類。 1.3流動(dòng)相 ；流動(dòng)相要求： 1.3.1選用的溶劑應(yīng)當(dāng)與固定相互不相溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性 1.3.2選用的溶劑應(yīng)有高純度，以防所含微量雜質(zhì)在柱中積累，引起柱性能的改變。 1.3.3選用的溶劑性能應(yīng)與所使用的檢測(cè)器相匹配，如果使用紫外吸收檢測(cè)器，就不能選用在檢測(cè)波長(zhǎng)下有紫外吸收的溶劑；若使用示差折光檢測(cè)器，就不能用梯度洗脫。 1.3.4選用的溶劑應(yīng)對(duì)樣品有足夠的溶解能力，以提高測(cè)定的靈敏度。 1.3.5選用的溶劑應(yīng)具有低的黏度和適當(dāng)?shù)偷姆悬c(diǎn)。 1.3.6應(yīng)盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑，以保證工作人員的安全 1.4應(yīng)用 液固色譜是以表面吸附性能力為依據(jù)的，所以它常用于分離極性不同低的化合物，也能分離那些具有相同極性基團(tuán)，但數(shù)量不同的樣品。 液液分配色譜1.1分離原理 ；分配色譜法的原理與液液萃取相同，都是分配定律。 1.2固定相 ；分配色譜固定相由兩部分組成，一部分是惰性載體，另一部分是涂漬在惰性載體上的固定液。 1.3流動(dòng)相 ；分內(nèi)色譜中，要求流動(dòng)相盡可能不與固定液互溶 1.4應(yīng)用 ；既能分離極性化合物，又能分離非極性化合物。由于不同極性鍵合固定相的出現(xiàn)，分離的選擇性可得到很好的控制。 鍵合相色譜1.1分離原理 1.1.1正鍵合相色譜分離遠(yuǎn)離：使用的是極性鍵和固定性，溶質(zhì)在此類固定相上的分離機(jī)理屬于分配色譜。 1.1.2反鍵合相色譜分離原理：使用的是極性較小的鍵合固定相，其分離機(jī)理可用疏溶劑作用理論來(lái)解釋。 1.2固定相 ；按極性大小可分為非極性、弱極性、極性化學(xué)鍵合固定相三種。 1.3流動(dòng)相 1.3.1正鍵合相色譜中，采用和反相液液分配色譜相似的流動(dòng)相，流動(dòng)相的主體成分為己烷或庚烷。 1.3.2反相鍵合相色譜中，流動(dòng)相采用和反相液液分配色譜相似的流動(dòng)相，主題為水。 1.4應(yīng)用 1.4.1正鍵合相色譜法的應(yīng)用：多用于分離各類極性化合物如染料、炸藥、多巴胺、氨基酸等； 1.4.2反鍵合相色譜法的應(yīng)用：由于操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，該方法已成為一種通用型液相色譜分析方法。在生物化學(xué)、醫(yī)藥研究、食品分析和環(huán)境污染分析等多個(gè)領(lǐng)域有了很大的應(yīng)用和發(fā)展。 凝膠色譜凝膠色譜又稱分子排阻色譜，它是按照分子尺寸大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。凝膠色譜法的固定相凝膠是一種多孔性的聚合材料，有一定的形狀和穩(wěn)定性。根據(jù)所用流動(dòng)相的不同，凝膠色譜法可以分為兩類：即用水溶劑做流動(dòng)相的凝膠過(guò)濾色譜法（GFC）與用有機(jī)溶劑如四氫呋喃做流動(dòng)相的凝膠滲透色譜法（GPC）。 應(yīng)用高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動(dòng)相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。 與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合，HPLC 所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時(shí)測(cè)定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能，能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。 HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無(wú)機(jī)分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。 液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等； 液相色譜- 紅外光譜聯(lián)用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測(cè)定水中的烴類，海水中的不揮發(fā)烴類，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《高效液相色譜儀》（GB/T 26792-2011）《High performance liquid chromatography》于2011年12月1日實(shí)施。 |